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近日，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所使用融智生物QuanSNP核酸質譜平臺建立了肺炎支原體（MP）多位點SNP分型與大環內酯類抗生素（ML）耐藥同時檢測的方法。相關研究結果已經發表在iScience上，文章標題為“A multisite SNP genotyping and macrolide susceptibility gene method for Mycoplasma pneumoniae based on MALDI-TOF MS”（?https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102447）。文章的第一作者為趙飛研究員，通訊作者為肖迪研究員，融智生物作為合作單位參與其中。
?肺炎支原體（MP）是引起兒童及成人呼吸道感染的重要病原菌，每年約10%-30%的社區獲得性肺炎病例由其感染引起。大環內酯類抗生素（ML）是臨床MP感染治療的一線藥物，尤其在兒童中使用非常普遍。2000年以后，國際上ML耐藥MP比例持續升高，中國MP的ML耐藥率一直居高不下。MP的ML耐藥與其23S rRNA基因突變密切相關，其中2063、2064突變與ML高水平耐藥相關，2617突變與低水平耐藥相關。因此，上述位點的基因檢測成為可替代ML體外藥敏實驗，快速檢測MP的ML耐藥的技術。目前耐藥基因檢測最常用的方法有熒光PCR的高分辨率熔解曲線（HRMA）法、限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法和焦磷酸測序法。
基因分型是MP分子生物學與流行病學特征研究的重要手段。MP基因組高度保守，菌株間相似度高達99%，基于單核苷酸變異和基因插入缺失，肺炎支原體明確分為兩種基因型?；趐1基因的PCR-RFLP分型、基于pl基因的VNTR分型以及基于MPN459/MPNA5864基因的熒光PCR技術是目前常用的MP基因分型技術。盡管操作相對簡便，但靶位點單一導致區分能力有限，是此類方法的劣勢。多位點的MLVA及MLST分型技術相繼報道，有效提升了MP分型能力。然而，上述基因分型技術耗時且技術要求高，使其應用受到限制。如果再加上MP耐藥基因檢測，則MP基本分子生物學特征檢測過程更加繁瑣耗時，因此需要研發新型快速、低成本的分型與耐藥檢測技術。
基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術近年來被用于單位點核苷酸多態性（SNP）檢測。其檢測原理是，首先使用多重PCR擴增含SNP靶位點的目的基因；其次，通過特異性質量探針進行SNP位點延伸，最后通過MALDI-TOF MS鑒定不同質量探針分子量得到檢測結果。
基于MALDI-TOF MS的SNP分型分析，在手足口病毒、HBV檢測以及HPV分型等方向已經廣泛應用，并且具有取代傳統鑒定技術的潛力?；贛ALDI-TOF MS的SNP分析方法具有高通量、快速、多靶標同時檢測的優點，是當前最有應用前景的生物分子技術之一。
圖1.?基于MALDI-TOF MS技術用于MP分型和耐藥基因檢測實驗流程圖（左）；
融智生物QuanSNP核酸質譜平臺（右）
在該研究中，開發了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS方法同時檢測MP的6個分型靶位點和3個ML耐藥基因。該方法對20種非MP菌株核酸均未檢測到質量探針延伸信號，表明該方法具有良好的特異性；肺炎支原體M129菌株用于檢出限測試，該方法最低檢出限為100拷貝/反應。使用141株臨床MP菌株的核酸樣本進行分型與耐藥分析，QuanSNP檢測結果與測序和藥敏結果一致率100%，表明該方法具有很好的鑒定準確性。在30例MP陽性臨床樣本中，25例中檢測到9個分型與耐藥SNP位點，檢測陽性率為83.3%，表明該方法具有良好的臨床標本分型和耐藥檢測能力，適用于MP類生長緩慢病原體的快速分型與耐藥檢測。
圖2-A 9個MPE質量探針的質譜圖
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?圖2-B?基于肺炎支原體菌株質量探針延伸后的質譜圖
基于融智生物的QuanSNP核酸質譜平臺，中國疾控中心傳染病預防控制所開發了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS的方法，同時檢測MP多位點分型以及ML耐藥基因，該方法具有操作簡便、特異性強、低成本以及高通量的優點。實現MP多位點SNP分型與ML耐藥基因的同時檢測，分型能力強且兼顧兩型菌株，耐藥位點檢測全面且準確，適用臨床標本檢測。同時，核酸質譜平臺可滿足客戶的不同檢測需求，在微生物鑒定、分型以及耐藥檢測中具有良好的應用前景。
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